Estudio del pH y la concentración de glicerol para la producción de antígeno recombinante de Plasmodium vivax usando Pichia pastoris
Study of pH and glycerol concentration to production of recombinant
Plasmodium vivax antigen using Pichia pastoris
Omar Pillaca-Pullo, Valker Feitosa, Irene Soares & Adalberto Pessoa-Jr
Facultad de Ciencias Farmacéuticas, Universidad de São Paulo, Brasil
DOI: https://doi.org/10.33017/RevECIPeru2014.0009/
Resumen
La levadura metilotrófica Pichia pastoris es ampliamente usada como un sistema eucariota para expresar proteínas recombinantes. Más de 500 proteínas recombinantes fueron expresas por P. pastoris con niveles de expresión que alcanzan hasta el 80% de proteínas totales secretadas y hasta 30% de proteínas totales de la célula. El proceso productivo está compuesto por una fase de crecimiento con glicerol y luego por una fase de inducción con metanol. El control de las condiciones de cultura (pH, temperatura, concentración de inductor, fuente de carbono y nitrógeno, etc.) son factores importantes tanto para el crecimiento de la levadura como para la producción de la proteína. Por su parte, la malaria es una enfermedad con gran importancia para la salud pública mundial debido a su alta prevalencia principalmente en los países tropicales. En los últimos años hubo un avance en la investigación de vacunas contra las especies de Plasmodium, dentro de las principales proteínas antigénicas están el Antígeno de Membrana Apical (AMA) y la Proteína de Superficie de Merozoíto (MSP) que pueden ser administradas aisladas, en combinación o conjugadas (quimera). En este estudio fueron evaluados el pH inicial del medio (3.0 a 8.0) y la concentración inicial de glicerol (0 a 60 g.L-1) en el crecimiento la levadura, después de determinadas las cantidades de biomasa seca obtenida en cada punto, se tomaron tres valores de pH (6.0, 7.0 y 8.0) y tres concentraciones diferentes de glicerol (10, 30 y 50 g.L-1) y se realizaron experimentos con combinaciones de dichos parámetros. Los datos mostraron que la condición de mejor producción del antígeno recombinante de Plasmodium vivax (PvAMA166-MSP119) fue a pH 7.0 y 30 g.L-1 de glicerol y que altas concentraciones de glicerol provocan una mayor disminución del pH final afectando la producción del antígeno recombinante y aumentando el riesgo de proteólisis. Finalmente se recomienda evaluar dicha producción en biorreactor donde se lleve un control adecuado del pH con uso de hidróxido de amonio para corregir el pH el cual también es aprovechado por la levadura como fuente de nitrógeno.
Descriptores: Pichia pastoris, Plasmodium vivax, Antígeno recombinante
Abstract
The methylotrophic yeast Pichia pastoris is widely used as a eukaryotic system for expressing recombinant proteins. Over 500 recombinant proteins were expressed by P. pastoris with expression levels reaching up to 80% of total secreted proteins and up to 30% of total cell protein. The production process consists of a growth phase with glycerol and then an induction phase with methanol. Control culture conditions (pH, temperature, concentration of inducer, carbon and nitrogen source, etc.) are important for the growth of yeast to the production of the protein factors. On the other hand, malaria is a disease of great importance to global public health because of it is high prevalence mainly in tropical countries. In recent years there has been a breakthrough in the research of vaccines against Plasmodium species within the major antigenic proteins are the Antigen Membrane Apical (AMA) and Merozoite Protein Surface (MSP) that can be administered singly, in combination or conjugate (chimera). In this study were evaluated initial medium pH (3.0 to 8.0) and the initial concentration of glycerol (0 to 60 gL-1) on growth of yeast, after analyzed amounts of dry biomass obtained at each point, were taken three pH values (6.0, 7.0 and 8.0) and three different concentrations of glycerol (10, 30 and 50 gL-1) and experiments were performed with combinations of these parameters. The data showed that the best condition producing the recombinant antigen of Plasmodium vivax (PvAMA166-MSP119) was at pH 7.0 and 30 gL-1 of glycerol and that high concentrations of glycerol cause higher final pH decrease affecting the production of recombinant antigen and increasing the risk of proteolysis. Finally it is recommended to evaluate this production in bioreactor where adequate control of pH is carried with use of ammonium hydroxide to adjust the pH which is also used by the yeast as a nitrogen source.
Keywords: Pichia pastoris, Plasmodium vivax, Recombinant antígen