Interaction between a peptide fragment of the human receptor type 1 of angiotensin and model membranes
Nélida Marín Huachaca1, Clóvis R. Nakaie2 y Shirley Schreier1
1 Departamento de Bioquímica de la Universidade de São Paulo, Av. Prof. Lineu Prestes 748, CEP: 05513-970 São Paulo, Brasil
2 Departmento de Biofísica de la Universidade Federal de São Paulo, Rua 3 de Maio 100, CEP: 04044-020, São Brasil.
DOI: https://doi.org/10.33017/RevECIPeru2015.0019/
Resumen
El receptor tipo 1 de angiotensina (AT1) humano pertenece a la superfamilia de receptores acoplados a Proteínas G (GPCR). Estudios conformacionales de fragmentos peptídicos de GPCR requiere el uso de sistemas que mimeticen el ambiente del receptor. El presente estudio propone investigar la interacción del fragmento peptídico Ac-YRWPFGNYL-CONH2 (fEC1), que corresponde a los residuos de aminoácidos 92 100 del primer bucle extracelular del receptor AT1 humano, con sistemas miméticos de membrana biológica micelas y vesículas unilamelares grandes (LUV). Las micelas fueron preparadas a partir de los lisofosfolípidos: 1-palmitoil-2-hidroxi-fosfatidilcolina (LPC) y 1-palmitoil-2-hidroxi-fosfatidilglicerol (LPG), mientras que, las LUV fueron preparadas a partir de 1-palmitoil-2-oleoil-fosfatidilcolina (POPC) y 1-palmitoil-2oleoil-fosfatidilglicerol (POPG). El péptido fEC1 fue sintetizado por el método de síntesis en fase sólida. Se realizaron medidas de fluorescencia utilizando, como sonda fluorescente intrínseca, el residuo de triptófano (W94), presente en la secuencia de aminoácidos de fEC1. La longitud de onda de excitación (exc) fue de 195 nm. Los espectros de fluorescencia de fEC1 (10 M) fueron obtenidos en concentraciones crecientes de lisofosfolípidos o de fosfolípidos. La intensidad de fluorescencia del péptido aumentó en la presencia de micelas tanto zwitteriónica (LPC) como aniónica (LPC: LPG, mol:mol) y, en la presencia de LUV aniónica (POPC:POPG, mol:mol). Asimismo, se observaron desplazamientos de las longitudes de onda de emisión máxima (max) hacia el azul. Las alteraciones espectrales observadas son debido a la sensibilidad del triptófano a la polaridad del medio en que se encuentra. A partir de las isotermas de interacción fueron determinadas las constantes de asociación (Ka). De acuerdo a estos valores, la interacción del péptido con los sistemas aniónicos fue mayor que con los zwitteriónicos debido a la contribución de fuerzas electrostáticas. Para los estudios de supresión de fluorescencia se utilizó acrilamida como supresor colisional y se determinaron las constantes de Stern-Volmer. Conforme a estos valores, el fluoróforo está más expuesto a la acrilamida cuando fEC1 está en solución que cuando está en la presencia de sistemas biomiméticos, lo cual es debido a la interacción del péptido con estos sistemas. Asimismo, se calcularon los valores de anisotropía de fluorescencia (r) los cuales están relacionados al movimiento de difusión rotacional de un fluoróforo. De acuerdo a estos datos, el péptido presenta mayor movimiento de difusión rotacional en medio acuoso que cuando interactúa con los sistemas modelo. Los resultados obtenidos, a través de la fluorescencia de estado estacionario, muestran la interacción del fragmento peptídico fEC1 con micelas de lisofosfolípido, LUV de POPC: POPG y, en menor extensión, con LUV de POPC.
Descriptores: Receptor AT1 humano, dicroísmo circular, fluorescencia, sistema mimético de membrana biológica.
Abstract
The type 1 angiotensin (AT1) receptor belongs to G protein coupled receptors (GPCR) superfamily. Conformational studies of GPCR peptide fragments require the use of systems that mimic the receptor environment. The current study aims to investigate the interaction of the peptide fragment Ac-YRWPFGNYLCONH2 (fEC1), corresponding to amino acid residues 92 -100 of the first extracellular loop of the human AT1 receptor, with model membranes –micelles and large unilamellar vesicles (LUV). The micelles were prepared from lysophospholipids: 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (LPC) and 1-palmitoyl-2-hydroxysn-glycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol) (sodium salt) (LPG) and, LUVs were prepared from 1-palmitoyl-2oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) and 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol) (sodium salt) (POPG). The peptide fEC1 was synthesized by solid-phase synthesis. Fluorescence measurements were performed using the tryptophan residue (W94), present in the amino acid sequence of fEC1, as an intrinsec fluorescent probe. The excitation wavelength (exc) was 195 nm. The fluorescence spectra of fEC1 (10 µM) were obtained at increasing concentrations of lysophospholipids or phospholipids. The fluorescence intensity of peptide in the presence of zwitterionic (LPC) and anionic (LPC: LPG, mol:mol) micelles and in the presence of anionic LUV (POPC:POPG, mol:mol) increased. Besides, upon addition of these model systems, a blue-shift of the maximum emission peak of the peptide was observed. The spectral changes observed are due to the sensitivity of tryptophan to the polarity of the medium. From the binding isotherms, binding constants (Kb) were determined. According to these values, the binding of the peptide with the anionic systems was higher than with the zwitterionic ones, this is due to the contribution of electrostatic forces. For fluorescence quenching studies, acrylamide was used as a collisional quencher, thus, SternVolmer constants were determined. According to these data, the fluorophore is more exposed to acrylamide when fEC1 is in solution than in the presence of the biomimetic membrane. Moreover, the values of fluorescence anisotropy (r) which are related to the rotational diffusion of a fluorophore were calculated. According to these data, the peptide showed higher rotational diffusion in aqueous medium than in presence of model systems. The results obtained by steady-state fluorescence show the binding of the peptide fragment fEC1 with lysophospholipid micelles, POPC: POPG LUV and, in lesser extent, with POPC LUV.
Keywords: Human AT1 receptor, circular dichroism, fluorescence, model membrane.